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[主观题]
质粒有()和松弛型两种类型，在克隆基因中常用的是松弛型，在表达研究中常用的是严紧型。
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为了形成稳定突变，需从重组克隆宿主(E.coli)中构建Pseudomonas aeruginosa的基因文库，并把该基因文库中克隆的突变基因转入一野生型组织。用已知的接合和质粒不相容性知识设计一方案。
有人建议用PCR扩增同该蛋白质结合的微量DNA，思路是(图Q25.8)：①合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点[图Q25.8(a)]；②把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；③用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；④用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。
图Q25.8 用随机的寡聚核苷酸选择和扩增特异的DNA序列(a)用于选择的原初随机序列的寡聚核苷酸，N代表任何一种核苷酸；EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点有利于选择DNA的克隆和序列分析。(b)同序列特异的DNA结合蛋白结合的寡聚核苷酸的选择和序列分析方案按照这一思路，用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链，经过如图Q25.8(b)所示的四轮选择和复制后，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ消化分离到的DNA，将片段克隆到质粒中，并测定了10个独立的克隆(表Q25.1)，问：
表Q25.1 10个克隆的序列
注：画线的序列是PCR引物部位，两种序列都是从BamH Ⅰ末端开始，所有序列中结合位点的方向都是相同的。
质粒pHUBI DNA是双链环状，长5.7kb(5.7×103个碱基对)。这个质粒带有某基因，它的蛋白质产物使宿主细菌对四环素具有抗性(Tet-r)。该DNA对下列每种限制酶具有一个识别位点：EcoRI、HpaI、BamHI、PstI、SalI、BglII。在BarnHI和SalI位点处克隆会破环四环素抗性；在其他酶的位点处克隆则保留四环素抗性。用各种限制酶以及酶混合物消化可得到如表16-2-11所列的DNA片段。试在pHUBIDNA图上标出所有这些酶的切点。将DNA图画成环形，在圆周上以5.7kb总长标出刻度。
| 表16-2-11 | |
| 酶混合物 | 片段长度(kb) |
| EcoRI EcoRI，BamHI EcoRI，HpaI EcoRI，SalI EcoRI，BglII EcoRI，PstI PstI，BglII BglII，HpaI | 5.7 0.4，5.3 0.5，5.2 0.7，5.0 1.1，4.6 2.4，3.3 1.3，4.4 0.6，5.1 |
许多双子叶植物被土壤农杆菌感染时，会产生冠瘿瘤。这种瘤是由土壤农杆菌中一个大型质粒(Ti)的DNA插入植物DNA中造成的。假设某种A型烟草(烟草有很多类型)被感染会产生瘤，其瘤组织被取下并于合成培养基中培养，其中的一些产生出气生根。将气生根嫁接至正常的B型烟草上，可以生长出外表正常的A型枝芽与花。 (1)取自嫁接植株的细胞在合成培养基中会长成肿瘤细胞，为什么嫁接植株生长正常？ (2)嫁接植株的种子可产生正常的A型植株，插入的质粒DNA片段在其中消失。试解释这种“回复”现象。
通过分析一个类似增强子元件(SRE血清反应元件)的一系列缺失突变体，发现在转录起始点上游的300核苷酸序列对于在加入血清后增强转录是必需的。通过建立包含有人β-球蛋白部分基因(它编码一个极为稳定的mRNA)的各种杂交基因来研究c-fos mRNA的稳定性。球蛋白基因的结构和两种杂交基因如图13-3-60(1)B、C、D所示。在低血清浓度下，当杂交基因转染鼠细胞时，24小时后它才对血清作出反应(图13-3-60(2)B、C所示)。
一个遗传学家想克隆脉孢菌的cys－1基因(已知该基因在5号染色体着丝粒附近)，该区域附近有两个RFLP标记(RFLPl和RFLP2)，他作了以下杂交。 cys－1(O型)×cys－1+(M型) 检验了100个子囊孢子的RFLP和cys－1基因型，结果如下：
1.jpg)
(1)cys－1在染色体的这个区域吗？ (2)如果是，画出cys－1基因在该区域的染色体图，标出图距。 (3)下一步怎样克隆cys－1基因？
二氢叶酸还原酶缺陷型(dfr-)仓鼠细胞株用质粒转化，该质粒含dfr-结构基因，并与激素诱导基因的启动基因以及另一个在本系统是显性选择标记的基因xgp相连。转化细胞根据合成Xgp的能力进行选择。所有这些挑选的细胞也都能合成Dfr。用剂量递增的氨甲蝶呤处理细胞。选择出一株细胞，比出发的转化细胞对氨甲蝶呤的抗性高200倍，同时Dfr酶含量也高200倍。
